Ngay sau khi thăm khám bệnh nhân, nếu nghi ngờ bệnh (dựa vào các yếu tố dịch tễ, miễn dịch, biểu hiện lâm sàng) thì động tác quan trọng nhất là lấy giả mạc hoặc phết bệnh phẩm ở chỗ tổn thương nghi ngờ bạch hầu. Và nếu lâm sàng nghi ngờ bạch hầu thì nên tiến hành điều trị ngay mà không chờ kết quả cận lâm sàng.

Xét nghiệm nhanh nhờ vào nhuộm Gram và nhuộm Kennyon. Vi khuẩn có thể bắt màu nhuộm Gram dương, mảnh, hình dùi trống, sắp xếp theo kiểu hình hàng rào hoặc hình Hán tự. Không thấy C. diphtheriae khi nhuộm cũng không thể loại trừ nguyên nhân bạch hầu.

Chẩn đoán xác định nhờ vào việc cấy và định danh vi khuẩn nhưng quá trình này thường đòi hỏi thời gian. Ngoài việc nuôi cấy nhằm phân lập C. diptheriae thì bệnh phẩm cũng được nuôi cấy trên đĩa thạch chứa máu để phát hiện liên cầu khuẩn tan máu vì loại vi khuẩn này cũng có thể gây nên biểu hiện tại chỗ trong hầu họng giống với bạch hầu.